Anti Tiroid Peroksidaz Elisa Test Kiti Anti TPO Antikor Test Kitleri

Anti-TPO Anti-Tiroid Peroksidaz Elisa Kiti

1. Kullanım amacı

İnsan serumunda tiroid peroksidaza karşı antikorların in vitro kantitatif tayini için immünoanaliz.Anti-TPO tayini, otoimmün tiroid hastalıklarının teşhisinde yardımcı olarak kullanılır.

2. Özet 

• Tiroide özgü peroksidaz (TPO), tirositlerin mikrozomlarında bulunur ve apikal hücre yüzeyinde eksprese edilir.Tiroglobulin (Tg) ile sinerji içinde bu enzim, L-tirozinin iyodinasyonunda ve ortaya çıkan mono- ve di-iyodotirozinin kimyasal olarak bağlanmasında tiroid hormonları T4, T3 ve fT3'ü oluşturmak için temel bir işleve sahiptir.
• TPO potansiyel bir otoantijendir.TPO'ya karşı yüksek serum antikor titreleri, otoimmünitenin neden olduğu çeşitli tiroidit türleri.Halen sıklıkla bulunan "mikrozomal antikor" terimi, mikrozomların neden olduğu otoimmünitede TPO'nun henüz bir antijen olarak tanımlanmadığı zamandan kaynaklanmaktadır.Klinik anlamda iki terim anti-TPO ve mikrozomal antikor eşanlamlı olarak kullanılabilir;Bununla birlikte, test yöntemleri açısından farklılıklar vardır.
• Yüksek anti-TPO titreleri, kronik Hashimoto tiroiditi olan hastaların %90 kadarında bulunur.Graves hastalığında hastaların %70'inde titre yüksektir.Eş zamanlı olarak diğer tiroid antikorları (anti-Tg, TSH-reseptör-antikoru - TRAb) belirlenerek işlemin duyarlılığı arttırılabilse de, negatif bir bulgu otoimmün hastalık olasılığını dışlamaz.Antikor titresinin büyüklüğü, hastalığın klinik aktivitesi ile ilişkili değildir.Başlangıçta yüksek titreler, uzun hastalık dönemlerinden sonra veya remisyon sırasında negatif olabilir.Remisyondan sonra antikorlar yeniden ortaya çıkarsa, nüks olasıdır.
• Olağan mikrozomal antikor testlerinde antijen preparasyonu olarak saflaştırılmamış mikrozomlar kullanılırken, anti-TPO testleri saflaştırılmış peroksidaz kullanır.İki prosedür, klinik duyarlılık açısından karşılaştırılabilir performansa sahiptir, ancak kullanılan antijenin daha yüksek kalitesi nedeniyle anti-TPO testlerinden daha iyi lottan lota tutarlılık ve daha yüksek klinik özgüllük beklenebilir.Enzim bağlantılı immünosorbent deneyleri, insan antijenini kullanır ve tavşan anti-insan IgG antikorları (anti-IgG).

3. Test prensibi

Dolaylı yöntem, toplam test süresi: 70 dakika.

Anti-TPO ELISA, iki aşamalı inkübasyon prosedüründe TPO'ya karşı antikorların tespiti için katı faz, dolaylı ELISA yöntemini kullanır.Polistiren mikrokuyu şeritleri, yüksek düzeyde immünoreaktif insan TPO antijenleri ile önceden kaplanmıştır.İlk inkübasyon adımı sırasında, varsa anti-TPO'ya özgü antikorlar, katı faz önceden kaplanmış TPO antijenlerine bağlanacaktır.Kuyucuklar, bağlanmamış serum proteinlerini çıkarmak için yıkanır ve yaban turpu peroksidaz enzimine (HRP-Konjugat) konjuge tavşan anti-insan IgG antikorları (anti-IgG) eklenir.İkinci inkübasyon adımı sırasında, bu HRP-konjuge antikorlar, önceden oluşturulmuş herhangi bir antijen-antikor (IgG) kompleksine bağlanacak ve bağlanmamış HRP-konjugatı daha sonra yıkama ile uzaklaştırılacaktır.Kuyucuklara Tetrametilbenzidin (TMB) ve üre peroksit içeren kromojen solüsyonları eklenir ve antijen-antikor-anti-IgG (HRP) immün kompleksi varlığında renksiz Kromojenler bağlı HRP konjugatı tarafından mavi renkli bir ürüne hidrolize edilir.Sülfürik asit ile reaksiyon durdurulduktan sonra mavi renk sarıya döner.

Renk yoğunluğu miktarı ölçülebilir ve sırasıyla kuyucuklarda yakalanan antikor miktarı ve numunedeki antikor miktarı ile orantılıdır.

4. Reaktifler Sağlanan malzemeler

• Kaplamalı Mikroplaka, 8 x 12 şerit, 96 kuyu.İnsan TPO antijeni ile önceden kaplanmıştır.

• Kalibratörler, 6 şişe, her biri 1 mL, kullanıma hazır;Konsantrasyonlar: 0(A), 25(B), 50(C), 100(D), 250(E) ve 500(F) IU/mL.

• Enzim Konjugatı, 1 şişe, BSA (sığır serum albümini) içeren Tris-NaCl tamponu içinde 11.0 mL HRP (yaban turpu peroksidaz) etiketli tavşan anti-insan IgG antikorları (anti-IgG).%0,1 ProClin300 koruyucu içerir.

• Serum Seyreltici: 1 şişe, 11 mL.Tampon tuzları ve bir boya içeren

• Yıkama Solüsyonu Konsantresi, 1 şişe, 25 ml (40X konsantre), PBS-Tween yıkama solüsyonu.

• Substrat, 1 şişe, 11ml, kullanıma hazır, (tetrametilbenzidin) TMB.

• Stop Solution, 1 şişe, 6,0 ml 1 mol/l sülfürik asit.

• Kullanım Talimatları, 1 kopya.

• Plaka Kapağı: 2 adet.

Gerekli malzemeler (ancak sağlanmadı)

• 450nm ve 620nm dalga boyunda emici özelliği olan mikroplaka okuyucu.

• Mikroplaka yıkayıcı.

• İnkübatör.

• Plaka çalkalayıcı.

• %1.5'ten daha iyi bir hassasiyetle 50µl sağlayan mikropipetler ve çok kanallı mikropipetler.

• Emici kağıt.

• Arıtılmış su

5. Test prosedürü

• Test edilecek her kalibratör ve numune için yalnızca gereken sayıda kuyu kullanın ve mikroplaka kuyularını biçimlendirin.

• Her kuyucuğa 100 µL kalibratör ekleyin.

• Kalibratör kuyuları hariç her kuyucuğa 100 µL Sample Diluent (Yeşil renk) ekleyin.

• Her Numune Seyreltici kuyusuna 10 µL Numune ekleyin (NOT: Kuyulardaki Reaktifler Yeşilden Maviye döner), ardından 30 saniye sallayın.

• Plakayı bir plaka kapağı ile kapatın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.

• Mikro plakanın içeriğini dekantasyon veya aspirasyon yoluyla atın.Boşaltma yapıyorsanız, plakaya hafifçe vurun ve emici kağıtla kurulayın.

• 350 µL yıkama solüsyonu ekleyin, boşaltın (dokun ve blot) veya aspire edin.Toplam 5 yıkama için 4 kez daha tekrarlayın.Yıkamanın sonunda, plakayı ters çevirin ve kalan yıkama solüsyonunu emici kağıt üzerine hafifçe vurun.

• 100 µL enzim konjugatı ekleyin,

• Plakayı bir plaka kapağı ile kapatın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.

• 350 µL yıkama solüsyonu ekleyin, boşaltın (dokun ve blot) veya aspire edin.Toplam 5 yıkama için 4 kez daha tekrarlayın.Yıkamanın sonunda, plakayı ters çevirin ve kalan yıkama solüsyonunu emici kağıt üzerine hafifçe vurun.

• Her kuyucuğa 100 µL Substrat ekleyin.Üzerini örtün ve ortam sıcaklığında (18-25°C) karanlıkta reaksiyon için 10 dakika inkübe edin.Substate ilavesinden sonra plağı sallamayın.

• Her kuyucuğa 50 µL durdurma solüsyonu ekleyin.

• Kuyuların içindeki sıvının karışması için 15-20 saniye çalkalayın.Mavi rengin tamamen sarıya dönüşmesini sağlamak önemlidir.

• Her kuyunun absorbansını 450 nm'de (kuyu kusurlarını en aza indirmek için referans dalga boyu olarak 620 ila 630 nm kullanarak) bir mikro plaka okuyucuda okuyun.Sonuçlar, durdurma solüsyonu eklendikten sonra 30 dakika içinde okunmalıdır.